Orientador(es): CESAR LUIS SIQUEIRA JUNIOR
Área temática: BIODIVERSIDADE
Modalidade de apresentação: SESSÃO ORAL
Bolsa: PIBIC
O consumo de derivados lácteos pela população brasileira, principalmente os queijos, vêm crescendo exponencialmente. A produção desse alimento depende do uso de coagulantes, sendo a quimosina comercial o principal coagulador utilizado pelas indústrias. Considerando que a origem deste coagulador advém do abomaso de bezerros, a utilização de outro coagulador, dessa vez proveniente de uma fonte vegetal como a Melia azedarach, torna-se uma alternativa mais sustentável e econômica tendo em vista o rápido e constante crescimento dessa espécie. Além disso, o consumo do queijo produzido rotineiramente pela quimosina ainda é desprezado por determinados grupos. O objetivo desse trabalho foi detectar e purificar parcialmente uma protease com função coaguladora de leite em tecido foliar de Cinamomo (Melia azedarach). A metodologia utilizada foi realizada no Laboratório de Bioquímica e Função das Proteínas Vegetais, na UNIRIO. Em um primeiro momento foi realizada a etapa de obtenção do extrato bruto da planta a partir de seu tecido foliar. As folhas foram coletadas na cidade de Campos dos Goytacazes, interior do RJ, higienizadas e em seguida mantidas em estufa a 40ºC até total desidratação, quando então foram pulverizadas para uso nos experimentos. A dosagem de proteínas no extrato bruto proteico e nas frações obtidas com o processo de purificação foi avaliada, tendo como referência a curva padrão da proteína BSA e a presença de protease coaguladora de leite no extrato bruto e frações foi avaliada. O processo de purificação da protease foi iniciado por precipitação em sulfato de amônio, adicionando-se concentrações de 0 a 15% e 15 a 20%, resultando na separação de frações proteicas F15 e F20. Em cada concentração de sal utilizada, a mistura foi agitada por 1 hora e então centrifugada a 4ºC, por 20 minutos a 10.000 xg. O sobrenadante foi utilizado para o fracionamento com o aumento da concentração de sal, enquanto que o sedimento (pellet) foi armazenado como frações para avaliação da presença da protease. As frações foram submetidas ao ensaio de atividade coagulante de leite (MCA) para a detecção da protease de interesse, e sua atividade coaguladora de leite foi mensurada em U/mL. Alíquotas da fração contendo a protease foram então submetidas ao processo de cromatografia líquida em gel filtração, utilizando como matriz a resina Bio-Gel® P-100 Medium em um fluxo de 0,6 mL/min, utilizando-se como eluente a solução CaCl₂ 10 mM (pH 7). As frações eluídas da coluna foram avaliadas quanto a presença de proteínas por espectrofotometria a 280 nm e as frações contendo proteínas foram posteriormente avaliadas quanto a presença da protease com atividade coaguladora de leite. Os resultados sugerem que a purificação parcial em sulfato de amônia apresentou capacidade coaguladora de leite na fração F20, resultante do fracionamento do extrato bruto em sal na concentração de 15 a 20%, indicando a presença da proteína de interesse nesta fração proteica. Subsequentemente, as frações coletadas no processo de cromatografia em coluna de gel filtração foram avaliadas pela presença de aminoácidos, indicando que as frações 28 a 40 e 77 a 140 apresentam proteínas. Compreende-se, portanto, que o processo de purificação aplicado foi eficiente na concentração e isolamento de proteínas com potencial atividade coagulante.
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